Kuantifikasi protein kolorimetri spektrofotometri
Protein biasanya merupakan campuran protein. Tes kolorimetri didasarkan pada konstituen protein: Asam amino (misalnya tirosin, serin) bereaksi dengan tambahan kelompok atau pewarna kromogenik untuk menghasilkan bahan berwarna. Konsentrasi bahan berwarna secara langsung terkait dengan jumlah asam amino protein bereaksi, sehingga mencerminkan konsentrasi protein.
Metode kolorimetri
Ada beberapa metode seperti BCA, Bradford, dan Lowry.
Metode Lowry: Berdasarkan reaksi Biuret yang paling awal dan ditingkatkan. Protein bereaksi dengan Cu2 untuk menghasilkan reaksi biru. Namun, metode Lowry lebih sensitif daripada Biuret. Kerugiannya adalah kebutuhan untuk secara berurutan menambahkan beberapa reagen yang berbeda; reaksinya memakan waktu lama; rentan terhadap zat non-protein; protein yang mengandung EDTA, Triton x-100, dan amonia sulfat tidak cocok untuk metode ini.
Tes asam Bicinchoniinine: Ini adalah assay protein yang lebih baru dan lebih sensitif. Protein yang akan dianalisis bereaksi dengan Cu2 dalam larutan alkali untuk menghasilkan Cu, yang membentuk chelate dengan BCA untuk membentuk senyawa ungu dengan puncak serapan pada 562 nm. Hubungan linear antara konsentrasi senyawa ini dan proteinnya kuat, dan senyawa yang terbentuk setelah reaksi sangat stabil. Relatif dengan metode Lowry, operasinya sederhana dan sensitivitasnya tinggi. Namun, mirip dengan metode Lowry, ia rentan terhadap gangguan pada protein dan detergen.
Metode Bradford: Prinsip metode ini adalah bahwa protein bereaksi dengan Coomassie Brilliant Blue untuk menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada 595 nm. Fitur terbesarnya adalah sensitivitasnya, yaitu 2 kali lipat dari Lowry dan BCA. Ini lebih sederhana dan lebih cepat. Hanya membutuhkan satu jenis reagen reaksi. Senyawa dapat stabil selama 1 jam untuk memfasilitasi hasilnya; Mengganggu dengan Lowry, BCA bereaksi dengan reduktor (misalnya DTT, mercaptoethanol) yang kompatibel. Namun, masih sensitif terhadap deterjen. Kelemahan utama adalah bahwa standar yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan besar dalam hasil sampel yang sama dan tidak ada hasil yang sebanding.
Beberapa peneliti yang terkena pengukuran kolorimetri untuk pertama kalinya mungkin bingung dengan hasil berbagai tes kolorimetri. Metode apa yang Anda yakini membingungkan? Karena fakta bahwa kelompok bereaksi dengan cara yang berbeda dan kelompok kromogenik tidak sama, beberapa metode digunakan secara bersamaan untuk membuat konsentrasi sampel sampel yang sama tidak konsisten. Misalnya, Keller dkk. menguji protein dalam ASI dan menemukan bahwa konsentrasi yang diukur oleh Lowry dan BCA secara signifikan lebih tinggi daripada di Bradford. Perbedaannya signifikan. Bahkan jika sampel yang sama ditentukan, sampel standar yang dipilih dengan metode kolorimetri yang sama tidak konsisten, dan konsentrasi setelah tes juga tidak konsisten. Sebagai contoh, gunakan Lowry untuk menguji protein dalam homogenat sel, menggunakan BSA sebagai standar, dengan konsentrasi 1,34 mg / ml, dan globulin sebagai standar dengan konsentrasi 2,64 mg / ml. Oleh karena itu, sebelum memilih metode kolorimetri, lebih disukai untuk merujuk pada komposisi kimia dari sampel yang akan diuji, dan menemukan protein standar yang mirip kimia sebagai standar. Selain itu, metode kolorimetri untuk mengkuantifikasi protein sering menyebabkan masalah karena nilai absorbansi sampel terlalu rendah, menghasilkan perbedaan besar antara konsentrasi sampel yang diukur dan konsentrasi aktual. Masalah utamanya adalah warna bagian penting dari spektrofotometer 1011, kuvet, memiliki waktu paruh tertentu, sehingga setiap metode kolorimetri mencantumkan waktu uji reaksi. Semua sampel (termasuk sampel standar) Harus diuji dalam waktu ini. Jika waktu terlalu lama, nilai absorbansi yang diperoleh menjadi lebih kecil dan nilai konsentrasi yang dikonversi menurun. Selain itu, suhu reaksi, nilai pH larutan, dll. Semua faktor penting yang mempengaruhi percobaan. Selain itu, sangat penting untuk menggunakan kolorimetri plastik. Hindari menggunakan cuvettes yang terbuat dari kuarsa atau kaca karena warna setelah reaksi akan menyebabkan kuarsa atau kaca menjadi berwarna, sehingga menghasilkan penyerapan sampel yang tidak akurat.
Perusahaan ini mengkhususkan diri dalam penjualan spektrofotometer , menyambut pelanggan yang memiliki kebutuhan untuk berkonsultasi dan membeli, kami akan menyediakan Anda dengan layanan tulus dan produk berkualitas, serta harga yang lebih rendah.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com