Pengantar Prinsip Dan Penerapan Komponen Umum Spectrophotometer

Spektrofotometer banyak digunakan dalam penelitian biologi, kimia, klinis dan lingkungan.
Spektrofotometri mengukur seberapa banyak cahaya yang dapat diserap bahan kimia dengan melewatkan seberkas cahaya melalui sampel dalam spektrofotometer.
Dengan mengukur intensitas cahaya yang terdeteksi, metode ini dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi zat terlarut dalam sampel.
Konsep spektrofotometri
Sinar yang dikirim ke sampel terdiri dari sinar foton.
Ketika foton memenuhi molekul dalam sampel, molekul dapat menyerap sebagian dari mereka, mengurangi jumlah foton dalam berkas dan mengurangi intensitas sinyal deteksi.
Transmisi adalah bagian dari cahaya yang melewati sampel. Ini didefinisikan sebagai intensitas cahaya yang melewati sampel pada intensitas cahaya yang datang.
Absorbansi berlawanan dengan transmitansi, sesuai dengan jumlah yang diukur dengan spektrofotometer.
Menurut absorbansi, konsentrasi sampel larutan dapat ditentukan dari undang-undang Lambert, yang menunjukkan bahwa ada hubungan linier antara absorbansi dan konsentrasi sampel. Menurut hukum bir Lambert, absorbansi adalah produk dari koefisien absorpsi, yang merupakan ukuran jumlah cahaya yang diserap oleh zat terlarut pada panjang gelombang tertentu dan jarak yang dilalui cahaya. Sampel, atau jarak tempuh, dan konsentrasi terlarut. Secara umum, tujuan pengukuran absorbansi adalah untuk mengukur konsentrasi sampel.
Komponen spektrofotometer
Setiap spektrofotometer terdiri dari sumber cahaya, kolimator (lensa atau alat pemfokusan untuk mentransmisikan balok yang kuat dan lurus), monokromator untuk memisahkan balok dengan panjang gelombang berbeda, dan pemilih panjang untuk memilih gelombang atau alur dari panjang gelombang yang diinginkan. Panjang gelombang cahaya yang digunakan dalam spektrofotometer yang disajikan dalam video ini adalah dalam kisaran sinar ultraviolet dan cahaya tampak. Spektrofotometer juga termasuk pemegang sampel, fotodetektor dan layar yang menampilkan hasil detektor.
Spektrofotometer terbaru secara langsung digabungkan ke komputer, di mana parameter eksperimental dapat dikontrol dan hasilnya ditampilkan.
Prinsip kerja spektrofotometer
Saat melakukan spektrofotometri, penting untuk mengambil tindakan pencegahan yang tepat, seperti mengenakan sarung tangan, tergantung pada jenis larutan biologis atau kimia yang Anda gunakan.
Nyalakan perangkat dan biarkan lampu dan elektronik memanas sebelum mengukur spektrum UV-Vis sampel.
Siapkan sampel kosong dari larutan yang sama dengan pH yang sama dan kekuatan ion yang sama, tetapi tanpa komponen yang akan dianalisis; karena kuvet dan pelarut dapat menyebarkan cahaya, maka perlu untuk menganalisis sampel.
Tempat sampel spektrofotometer tradisional dirancang untuk menampung mangkuk plastik dan kuarsa. Pipet larutan asli ke dalam mangkuk.
Setelah menyeka sidik jari dan memercikkannya di bagian luar mangkuk, masukkan kuvet dengan benar ke dalam tempat sampel dan tutup pintu penutup.
Jangan lupa untuk menutup pintu karena radiasi UV dari spektrofotometer terbuka dapat merusak mata dan kulit Anda.
Programkan panjang gelombang atau rentang panjang gelombang yang diinginkan yang akan dikirim ke sampel. Ini tergantung pada panjang gelombang terbaik yang dapat diserap oleh komponen yang dianalisis. Mesin kemudian memusatkan perhatian dengan mengukur sampel kosong, yang mengurangi absorbansi bawah karena buffer sampel.
Tergantung pada jenis eksperimen spektrofotometri yang Anda lakukan, mungkin perlu untuk menghasilkan kurva standar sebelum pengukuran sampel, dari mana konsentrasi senyawa yang dianalisis dalam sampel dapat ditentukan.
Biarkan sampel mencapai suhu yang tepat dan aduk perlahan untuk menghindari gelembung yang masuk. Sampel kemudian dapat ditambahkan langsung ke mangkuk di dalam mesin dan bacaan dapat dibuat.
Setelah sampel diukur untuk absorbansi, percobaan dihitung dengan benar; misalnya, untuk menentukan konsentrasi atau tingkat aktivitas enzim.
Penerapan spektrofotometer
Salah satu kegunaan umum spektrofotometer adalah untuk mengukur kepadatan sel. Pengukuran kepadatan sel dapat digunakan untuk menghasilkan kurva pertumbuhan logaritmik bakteri, dari mana waktu optimal untuk integrasi protein rekombinan dapat ditentukan.
Spektrofotometer juga dapat digunakan untuk mengukur laju reaksi kimia. Dalam perwujudan ini, absorbansi digunakan untuk memonitor reaksi enzimatik, yang menghilang dengan waktu melalui reaksi antara 452nm. Tingkat langkah enzimatik ini dapat dihitung dengan mencocokkan data dengan persamaan yang sesuai.
Pengenalan spektrofotometer mikro menghilangkan kebutuhan pemegang sampel. Spektrofotometer ini menggunakan tegangan permukaan untuk mempertahankan sampel.
Microspectrophotometer adalah pilihan terbaik untuk mengukur massa dan konsentrasi sampel kecil dan mahal, seperti biomolekul, termasuk protein dan asam nukleat.
Absorbansi protein pada 280nm tergantung pada isi rantai samping aromatik yang ditemukan di triptofan, tirosin dan fenilalanin, serta ikatan disulfida antara kedua sistein.
Konsentrasi protein dapat ditentukan dengan absorbansi pada 280nm dan koefisien penyerapannya, yang didasarkan pada komposisi asam amino.
DNA dan RNA memiliki absorbansi maksimum pada 260nm, dari mana konsentrasi mereka dapat ditentukan. Kemurnian asam nukleat juga dapat dievaluasi dari rasio pembacaan absorbansi terhadap panjang gelombang tertentu.